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蔡司LSM-900共聚焦顯微鏡掃描圖像不清晰問題原因排查

1、掃描最終圖像清晰度不高

造成此類問題的原因主要有兩個(gè)：

①物鏡和ZOOM值選用不正確：

初學(xué)使用者大多喜歡選用共聚焦顯微鏡10x物鏡后，再將ZOOM值調(diào)到所需要的Zda值。通過ZOOM值的增大確實(shí)可以將圖像放大，有助于看清圖像的細(xì)節(jié)，但是ZOOM的增大是有限定的，這取決于物鏡的倍率。例如在10x物鏡下，ZOOM值超過10就沒有意義了，而且ZOOM值的增大屬于電子放大，放大倍數(shù)越高，清晰度越差。所以在所觀察的樣本形態(tài)體積較小的情況下，多采用高倍物鏡(例如63x水鏡或油鏡)，再適當(dāng)調(diào)整ZOOM值，ZOOM值Z好不超過2。

②誤將Z-Position旋轉(zhuǎn)球的功能和共聚焦顯微鏡焦距微調(diào)旋轉(zhuǎn)器的功能等同：

在準(zhǔn)確調(diào)焦的基礎(chǔ)上，通過Z-Position旋轉(zhuǎn)球的左右調(diào)節(jié)，可以觀察到目標(biāo)樣品圖像由Z軸距離變化而引起的圖像清晰度的改變，感覺上和通過調(diào)焦使圖像變清晰一樣。因此很多使用者在沒有調(diào)焦準(zhǔn)確的情況下，直接使用-Position旋轉(zhuǎn)球來調(diào)整圖像清晰度而導(dǎo)致成像模糊。

2、掃描背景強(qiáng)，圖像質(zhì)量差

解決這個(gè)問題的關(guān)鍵在于要根據(jù)樣品的制備質(zhì)量選取合適的針孔大小，調(diào)整激光管電壓、光電倍增管功率、信噪比等參數(shù)到Z佳狀態(tài)。這些參數(shù)或設(shè)置有非常密切的關(guān)系，選擇時(shí)應(yīng)該綜合考慮。

還有一種明場出現(xiàn)環(huán)狀波紋背景的情況是由于操作者在使用共聚焦顯微鏡觀察熒光樣品后，沒有將熒光濾鏡退出并切換到掃描狀態(tài)所致。此時(shí)只需要轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)輪至Scan即可。

3、串色

在使用多種熒光染料標(biāo)記樣品時(shí)或是樣品本身有很強(qiáng)的自發(fā)熒光時(shí)，串色的現(xiàn)象就很容易發(fā)生。串色又分為兩種情況：

①兩種熒光染料的激發(fā)光譜沒有重疊，但是吸收光譜有重疊。這類串色可以通過順序掃描(又稱序列掃描)來完成：即先使用一種熒光染料的激發(fā)光掃描一張圖片，再使用另外一種熒光染料的激發(fā)光掃描第二張圖片。

②兩種熒光染料的激發(fā)光譜和吸收光譜都有重迭，這種情況只能通過光譜掃描解決。